生物活动所引起的腐蚀和污损已被公认为是引起海洋钢铁构筑物诸如石油平台、管线、码头、船舶等腐蚀破坏的重要原因，给海洋工程的安全服役带来严重隐患，并造成巨大的经济损失。根据侯保荣院士主持的中国工程院重大咨询项目的调查报告，2014年我国的腐蚀总成本约占当年国民生产总值的3.34%,总额超过2万1千亿元人民币。其中，海洋腐蚀损失约占总腐蚀损失的1/3。

    洁净的材料浸入海水后，在数秒到更长的时间内，水中的有机分子、微生物以及其他海洋生物会陆续在其表面附着。这一过程通常可划分为4个阶段，即形成条件层、微生物附着形成生物膜、软体宏观污损和硬体宏观污损。在整个过程中，海洋生物与材料表面发生复杂的物理化学作用，引发严重的微生物腐蚀和生物污损问题。

    海洋材料表面微生物的附着、生长、繁殖、代谢、死亡等过程中所产生的物质直接或间接对材料造成的腐蚀称之为微生物腐蚀。统计表明，与海洋微生物附着有关的材料破坏占到涉海材料总量的70%~80%。微生物的存在可显着增大腐蚀速率，以码头中钢结构为例，微生物腐蚀引起的腐蚀速率最大可达4 mm/a,平均腐蚀速率也达0.3 mm/a。

    海洋生物在船体或水上设施表面的附着积累称为海洋生物污损，这是人类自开发利用海洋以来就面临的难题。生物污损的危害主要表现在降低船舶航速、影响海洋工程设施的安全运转、增加燃料消耗、阻塞隔膜管道、增加有害气体排放、危害水产养殖业等。

    近年来众多学者对中国近海码头，如旅顺港、青岛港、洋山港、厦门港、大亚湾码头、广西白龙码头等污损生物的群落结构及多样性进行了调查。结果表明，不同码头优势污损生物种类和数量不同，主要优势污损生物有柄海鞘、苔藓虫、紫贻贝、大型海藻、牡蛎、中胚花筒螅、泥藤壶、白脊藤壶、僧帽牡蛎等，但是以上这些调查均针对宏观污损生物。

    目前，对于实海挂片微生物的调查情况国内已有一定的报道。林燕顺等在厦门港进行冬季挂片，显示挂片1 h的不锈钢片上有细菌出现，挂放24 h后附着细菌绝大多数为革兰氏阴性球菌或短杆菌，主要有7种好氧优势菌，包括假单胞菌属、黄单胞菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、黄杆菌属、微球菌属等；挂放7 d后整个试板表面已覆盖有其他形态生物的复杂群落。吴进怡等[11]报道了海口海水中25钢片锈层中的微生物主要包括假单胞菌、弧菌、铁细菌、硫杆菌及硫酸盐还原菌 （SRB） 等；于洋等报道了烟台近海聚氯乙烯 （Poly vinylchloride,PVC） 板挂片上的微生物主要有假交替单胞菌、芽孢杆菌、盐单胞菌、嗜冷杆菌、肠杆菌等。以上研究标志着人们开始关注实海挂片微生物，不足之处在于研究多集中于某个海域的全浸区，而对不同海域不同腐蚀区带挂片样品锈层中微生物的对比调查却少有报道。

    本实验选择实际应用的海洋工程材料Q235碳钢，分别于黄海 （青岛）、南海 （三亚） 海域的不同腐蚀区带 （潮差区、全浸区） 进行实海挂片，采用传统的分离培养法和16S rDNA序列分析技术，从其锈层中分离获得可培养的微生物。并对比分析不同时空下全浸区、潮差区细菌种类的差别，为后续微生物腐蚀研究菌种的科学选择提供基础。

    1 实验方法

    1.1 样品规格及处理

    实验中所用挂片试样为200 mm×100 mm×5 mm的Q235碳钢，其化学成分 （质量分数，%） 为：C 0.18,Si 0.02,Mn 0.45,S 0.02,P 0.03,Fe余量。试样用砂纸逐级打磨至800#,并打孔标记。所有试样在挂片前分别经丙酮去油、酒精脱水和干燥处理。将试样分别挂在钢铁研究总院青岛腐蚀研究所小麦岛实验站和中国中船重工七二五研究所三亚腐蚀实验站的潮差区和全浸区，挂片时间为90,180和270 d。

    1.2 腐蚀速率的计算

    用硬毛刷除去试样表面的腐蚀产物，按照GB/T16545-2015规定的方法，采用含六次甲基四胺的HCl水溶液去除试片上的腐蚀产物后，再用去离子水冲洗，并用无水乙醇清洗后吹风机冷风吹干，放入干燥器中衡重。称重后与挂片前相比，计算出挂片的腐蚀失重与腐蚀速率。

    1.3 腐蚀产物的分析

    为研究锈层的组成，使用洁净刀片刮取试片表面的腐蚀产物，烘干后研钵研成粉末。将所得样品放入真空干燥器以备进行X射线衍射 （XRD） 分析 （UitimaIV型，CuKα射线，扫描速率10°/min,扫描范围5°~80°），判定其组成。

    1.4 锈层内微生物的获取

    达到挂片时间的样品，取样时先用数码相机拍照，尽量不要碰掉锈层，放置在干净、装海水的食品袋中，转移至实验室。在实验室无菌超净台内进行可培养微生物的分离，用事先灭菌的海水冲洗表面尽可能去除环境中的细菌。用镊子刮取锈层表面及内部，并用无菌海水冲洗锈层，获得微生物分散液。

    1.5 腐蚀与污损微生物的分离

    将盛有锈层微生物分散液的烧杯，用无菌枪头尽量吹打混匀。按照10倍梯度稀释的方法，将混合液进行稀释，然后分别将稀释10,100及1000倍3个梯度的稀释液涂布于事先准备好的2216E、柠檬酸铁铵平板培养基 （成分与用途详见表1）。并采用GB/T14643.5-93中规定的方法以特定培养基进行厌氧菌SRB的分离。将涂布平板放置在30 ℃恒温培养箱培养24~72 h。

    1.6 微生物的纯化

    2216E平板一般生长24~48 h即有明显的单菌落，柠檬酸铁铵培养基一般要达到72 h以上才有明显菌落生长，将平板上明显的单菌落进行三区划线培养于对应的培养基。重复2~3次，确保所获得菌株为纯培养后，再扩大培养并保存菌株。

    1.7 微生物的鉴定

    对分离纯化的菌种进行聚合酶链式反应 （PCR），首先取100 μL菌悬液，10000 r/min离心2 min后，去除培养基再加入80 μL的无菌水，吹打混匀后水浴煮沸10 min,再次离心即获得模板。使用16S rDNA的一对通用引物1492R/27F进行菌落PCR,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到目的条带约在1400bp的产物送去青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序，将测序结果在NCBI BLAST进行序列比对得到鉴定结果。

    2 结果与讨论

  2.1 挂片样品腐蚀形貌观察

    图1和2给出了Q235碳钢实海挂片180 d的部分代表性形貌图。可以看出，180 d后试样的表面完全被腐蚀产物覆盖。图1中青岛挂片样品腐蚀产物颜色偏砖红色和棕色，而图2中三亚挂片样品腐蚀产物颜色偏黑红色且挂片样品伴有泥沙。两个海域全浸区挂片样品外层形成了疏松的腐蚀产物层，内层呈黑色淤泥状；潮差区锈层较厚，出现裂纹，海水中Cl-等腐蚀性离子迅速透过裂纹与基体接触，促使腐蚀速率增加。且在锈层中微生物的分离实验过程中，全浸区腐蚀产物易脱离试样表面，潮差区腐蚀产物很难剥离。

    2.2 挂片腐蚀失重分析

    不同时空下不同腐蚀区带Q235碳钢实海挂片平均腐蚀速率见表2。可以看出，各海域不同腐蚀区带平均腐蚀速率有所差别，相同挂片时间下潮差区的均高于全浸区的 （约高出2倍）。这一结果与朱相荣等报道结果一致。

    本实验挂片起始时间为4月份，挂片周期为90和180 d,所得到的平均腐蚀速率相较于已报道的长期腐蚀数据偏大。以青岛海域为例，朱相荣等报道的Q235碳钢在全浸区、潮差区挂片1 a的平均腐蚀速率分别为0.19和0.22 mm/a;夏兰廷等报道的Q235碳钢挂片4 a的平均腐蚀速率在全浸区为0.13~0.14、潮差区为0.12~0.18 mm/a。这一偏差的出现与实海挂片腐蚀速率随时间的延长而减缓的普遍规律相一致。

    2.3 腐蚀产物成分分析

    青岛实海潮差区挂片180 d腐蚀产物外层成分复杂，主要有Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH,其中γ-FeOOH是主要成分 （图3a）。这与邹妍等报道Q235碳钢在海水中浸泡126 d时，外锈层主要是由γ-FeOOH组成的结果相一致[15]。内层腐蚀产物主要是Fe3O4和α-FeOOH。挂片180 d全浸区腐蚀产物外层主要是Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH,内层主要是Fe3O4 （图3b）。这与García的理论相一致，即越靠近金属表面溶解氧的含量越少，越有利于Fe3O4的形成，因此Fe3O4总是在靠近金属表面的区域形成。

    与青岛海域挂片结果相似，三亚实海潮差区和全浸区挂片6个月外层腐蚀产物主要成分也为Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH;同时，Fe3O4在内层腐蚀产物中占比大 （图4）。因此，在青岛和三亚海域Q235碳钢腐蚀产物成分差别不大。

    2.4 挂片锈层内SRB分离结果

    SRB是最为典型的腐蚀微生物。依照最大可能计数法 （MPN法） 的结果 （表3），不同时空下Q235碳钢实海挂片全浸区锈层内均检测到SRB,而潮差区锈层内均未检测到SRB。附着在金属表面的海洋生物阻碍了O的扩散，有利于减缓金属的腐蚀，但这层覆盖物中的好氧细菌能耗尽溶解氧成为生化障碍层，在金属表面形成厌氧环境，为SRB提供良好的生长繁殖条件，从而加速金属的腐蚀。这也是本实验在全浸区可以检测到SRB的主要原因，全浸区可形成SRB生存的厌氧条件；而潮差区一直处于干湿交替状态，加上O2含量较为丰富，不利于SRB的存活。

    2.5 挂片锈层内铁细菌分离结果

    铁细菌 （IOB） 是生活在含有高浓度Fe2+的池塘、湖泊、沼泽、污水排放管道、温泉等水域中，能将二价铁盐氧化成三价铁化合物，并能利用此氧化过程中产生的能量来同化CO2进行生长的细菌的总称[20]。IOB是参与Fe的氧化以及这些元素可溶性氧化物的沉淀过程的一类微生物,具有使Fe的氢氧化物沉淀的能力，然后Fe3+以Fe（OH）3的形式沉淀下来。有研究表明，IOB在铁锈的形成过程中发挥重要作用，其能在短时间内产生大量铁氧化物，并会对碳钢造成局部腐蚀。研究较多的铁细菌是生活在好氧或微好氧环境中的球衣菌属、纤发菌属、泉发菌属、嘉利翁菌属和假单胞菌属等。

    表4为Q235碳钢实海挂片锈层内分离铁细菌的情况。对比可见，三亚海域分离得到的铁细菌种类高于青岛海域，且全浸区较潮差区更易分离到铁细菌。已分离鉴定的铁细菌主要集中在弧菌属 （Vibrio sp.）、交替单胞菌属 （Alteromonas sp.）、假单胞菌属 （Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌属 （Bacillus sp.）、节杆菌属 （Arthrobacter sp.）、希瓦氏菌属 （Shewanella sp.） 等12个属内。Zakharova等从贝加尔湖沉积物中分离得到19株铁细菌，主要属于鞘铁细菌、瑙曼氏菌属、芽孢杆菌属3个属。Ashassi-Sorkhabi等从下水道污水处理装置中分离到2株铁细菌，分别是大头茶属和肠杆菌属。Xu等从循环冷却水系统分离到一株铁细菌为球衣菌属。与以上研究结果对比，可见不同海域不同分离物中铁细菌的种类差别较大。

    2.6 挂片锈层中优势好氧/兼性厌氧微生物分离

    结果目前大多学者都是对锈层中的SRB,IOB,硫氧化菌 （SOB） 等进行研究,而本实验除了对SRB和IOB等腐蚀性细菌进行分离外，还对锈层内优势好氧/兼性厌氧菌进行了分离鉴定。结果显示其主要集中Vibrio sp.、Pseudoalteromonas sp.、Bacillus sp.、产微球茎菌属 （Microbulbifer sp.）、交替单胞菌属 （Alteromonas sp.）、发光杆菌属 （Photobacterium sp.）、黏着杆菌属 （Tenacibaculum sp.）、红细菌科 （Rhodobacteraceae）、黄杆菌科 （Flavobacteriaceae）、α-变形杆菌 （Alpha proteobacterium）、肠杆菌属 （Enterobacter sp.）、赤杆菌属 （Erythrobacter sp.） 等20余个菌属中 （表5）。弧菌属细菌主要有溶藻弧菌 （Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌 （Vibrio parahaemolyticus）、以溶珊瑚弧菌 （Vibrio coralliilyticus）、强壮弧菌 （Vibrio fortis）、查氏弧菌 （Vibrio chagasii） 等。假交替单胞菌属主要包括藤黄紫假交替单胞菌 （Pseudoalteromonas luteoviolacea）、杀鱼假交替单胞菌 （Pseudoalteromonas piscicida）、Pseudoalteromonas phenolica、Pseudoalteromonas rubra等。全浸区分离的细菌种类均高于潮差区分离的。

    通过对比可见，本实验以弧菌属、假交替单胞菌属、芽孢杆菌属为优势菌。与吴进怡等认为45钢锈层中的微生物主要是由假单胞菌、弧菌、铁细菌、硫杆菌和SRB组成；杨雨辉等通过实验箱进行挂片分离到热带自然海水 （海南海口） 中需氧菌及兼性厌氧菌主要由假单胞菌属、弧菌属、黄杆菌科等细菌组成相比较，相同之处弧菌都是优势菌。其他结果不一致的原因可能是虽同为南海海域，但不同试验点 （三亚、海口） 以及室内实验条件和自然条件下受到季节、气候、波浪、海流及污染等的差异造成锈层内微生物优势种类的不同。此外，与挂片所用的材料 （45钢、Q235碳钢） 也有关系。

    栾鑫等用限制性片段长度多态性聚合酶链反应 （PCR-RFLP） 方法研究青岛近海实海全浸1 a的Q235碳钢内锈层细菌的多样性，认为锈层中优势菌为α-变形菌纲，主要包括玫瑰杆菌属、赤杆菌属、中慢生根瘤菌属、α-变形菌等种类，这与本文中同样在青岛挂片分离到的红细菌科属于α-变形菌纲，以及赤杆菌属和α-变形菌属等鉴定结果有相同之处，但是大部分菌种不同，原因可能与分离方法及挂片周期不同有关。

    在本实验中，Pseudoalteromonas sp.在不同时空下不同腐蚀区带均可以分离得到，这与吕建福等报道的假交替单胞菌属是海洋潮差区和浪溅区混凝土表面的优势菌结果相一致。鉴于该菌是实海挂片锈层中普遍存在的微生物，本课题组已经开展了关于其与腐蚀机理相关方面的研究。

    根据实验结果，不同海域的微生物种类差异较大，但优势种类多数集中在弧菌属、芽孢杆菌属、假交替单胞菌属等。这些种属主要分布在海水、底泥及锈层中，因此在进行防污杀菌实验时可以有针对性的选择此类在海水环境中广泛存在的微生物为研究对象。

    目前，关于传统的涂板方法结合16S rDNA序列分析的方法分离实海挂片可培养微生物方面的报道不多，平板分离法分离到的可培养细菌多样性研究不能完全覆盖到样品中所有菌群。但是，该方法不仅可以大致了解环境样品中细菌群落结构，还可以得到菌种，为后续研究工作提供支持。由于实验条件的限制，本文所获得的可培养细菌可能只是Q235碳钢锈层内细菌资源的一小部分，通过对培养基成分、培养时间和培养温度的优化可分离得到更多的细菌资源。本实验所获得的菌株对于后续腐蚀及污损微生物的筛选提供了一定的菌种库，为后期开展腐蚀机理研究的实验提供了良好的菌种保证。

    3 结论

    （1） Q235碳钢在不同海域不同腐蚀区带的腐蚀速率不同，且随时间的延长腐蚀速率均降低，潮差区的腐蚀速率总是大于全浸区的。锈层可分为内锈层和外锈层，外锈层由Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH等组成，内锈层主要含Fe3O4;青岛和三亚海域的腐蚀产物成分差别不明显。

    （2） Q235碳钢在不同时空下不同腐蚀区带挂片腐蚀产物中的细菌群落结构复杂，主要包括SRB、铁细菌和好氧/兼性厌氧菌等。全浸区锈层中分离的细菌种类和数量存在差异均多于潮差区的，且更易检测到SRB存在。好氧/兼性厌氧菌种类丰富，以弧菌属、芽孢杆菌属、假交替单胞菌属为优势菌。