拉曼光谱（Raman spectra）是一种散射光谱，由1928年印度物理学家C.V.Raman发现的。拉曼效应来源于分子振动（和点阵振动）与转动，从拉曼光谱中可以得到分子振动能级（点阵振动能级）与转动能级结构的信息，其谱图中包含的大量信息：拉曼位移的大小、强度及拉曼峰形状，半高宽等都是是鉴定化学键、官能团、结晶度、应变的重要依据。拉曼光谱以其信息丰富、制样简单、水的干扰小等独特优点，在化学、材料、物理、高分子、生物、医药、地质等领域有着广泛的应用。
随着科学发展的不断进步，普通的拉曼光谱技术已经不能满足研究需求，为此科学家们不断给拉曼光谱开外挂，发展了电化学原位拉曼光谱技术、受激拉曼散射（SRS）和表面增强拉曼散射（SERS）等，这些增强的技能让拉曼光谱在分子水平上现场表征、无标记生物医学成像、结构可视化等方面不断为科研人员做出神助攻。
本文将主要介绍这三种开挂的拉曼光谱技术：电化学原位拉曼光谱技术、受激拉曼散射（SRS）和表面增强拉曼散射（SERS），并从Science和其他优秀期刊中选取几篇具有代表性的工作对其相关应用进行介绍。
【简介】
表面增强拉曼散射效应是指在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中，在激发区域内，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强的现象，克服了拉曼光谱灵敏度低的缺点，可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信息。
受激拉曼散射是指高强度的激光和物质分子发生强烈的相互作用，使散射过程具有受激发射的性质，这种散射光是拉曼散射光，所以这一种非线性光学效应称受激拉曼散射。
电化学原位拉曼光谱法是利用物质分子对入射光所产生的频率发生较大变化的散射现象将单色入射光（包括圆偏振光和线偏振光）激发受电极电位调制的电极表面，通过测定散射回来的拉曼光谱信号（频率、强度和偏振性能的变化）与电极电位或电流强度等的变化关系。一般物质分子的拉曼光谱很微弱，为了获得增强的信号，可采用电极表面粗化的办法，可以得到强度高104-107倍的表面增强拉曼散射。
一、原位拉曼光谱技术研究铂单晶表面电催化ORR机理[1]
厦门大学的李剑锋教授和西班牙Alicante大学的Juan Miguel Feliu等人，采用原位电化学壳层隔绝纳米粒子增强拉曼光谱（SHINERS）系统地研究了Pt（hkl）单晶表面的ORR反应过程。该研究在Pt（111）单晶表面获得了ORR中间物种HO2*的光谱信号，在Pt（110）和Pt（100）单晶表面，获得了ORR中间物种OH*的光谱信号。而在碱性条件下，他们在Pt（hkl）三个基础单晶表面获得ORR过程的中间物种O2-的光谱信号。基于原位拉曼光谱实验数据和DFT理论模拟结果，他们认为在酸性条件下，当溶液中的O2分子吸附在Pt（hkl）单晶电极上形成吸附态的O2*后，经过质子电子转移步骤形成HO2*物种，HO2*再进一步通过O-O键的断裂在邻近Pt原子上形成一对吸附态的O*和OH*，最后OH*通过质子电子转移形成H2O。
图1. 酸性条件下，Pt（hkl）单晶表面ORR过程分析和Pt（111）单晶表面ORR过程的原位SHINERS研究及HO2*物种的DFT理论模拟
图2. 碱性条件下，Pt（hkl）单晶表面ORR过程的原位电化学SHINERS光谱图
本研究不仅获得了Pt（hkl）表面ORR反应过程中间物种的原位光谱信息，提出了合理的ORR机理，SHINERS技术为原子级平滑的单晶表面的催化过程的研究和其他界面催化反应过程的原位光谱研究提供了一种有效而可靠的原位光谱途径。
二、表面增强共振拉曼散射用于高精度癌症成像[2]
因为癌症能扩散渗透到周围的组织，且大多数癌症的扩散边界不能被清晰地划分，所以可视化癌症的扩散程度一直是肿瘤学领域的重大挑战。此外，癌症可能是多灶性的并且存在微观卫星病变，容易持续存在、局部复发和转移扩散，现有的成像技术不可能将其可视化。但是临床和手术需要一种揭示肿瘤真实扩散程度的成像方法，Stefan等人使用新一代表面增强共振拉曼散射（SERRS）纳米粒子（称为SERRS纳米星）显示肿瘤边缘，做到局部区域肿瘤扩散的精确可视化。SERRS纳米星具有星形金核，在近红外光谱中有拉曼共振，且不引入杂质。在基因修饰的小鼠模型中，以及一种人肉瘤异种移植模型中，SERRS纳米星能够准确检测到胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和肉瘤等肉眼可见的恶性病变以及其他显微疾病，而无需靶向部分。此外，SERRS纳米星的灵敏度（1.5 fM检测限）允许对胰腺和前列腺肿瘤的癌前病变进行成像。高灵敏度和广泛的适用性，结合其惰性金-二氧化硅组合物，使SERRS纳米星成为一种有前景的成像剂并应用于更精确的癌症成像和癌症切除。
图3. 小鼠模型中的乳腺癌成像
AB图是右上胸腺和右下胸腺中形成两个相邻的肿瘤，C图是沿着白色虚线切除肿瘤后切除床的光学图像和拉曼成像。未切除肿瘤时，抗PEG IHC染色显示肿瘤中存在SERRS纳米星，从拉曼成像中也能清晰直观的看到残留的肿瘤部分，与切除后PyMT染色显示的残留肿瘤位置形状等高度吻合。
SERRS纳米星是一类新的分子成像剂，能够描绘原发肿瘤，尺寸小至100微米的局部肿瘤沉积以及癌前病变。而且文中对相关动物模型的研究发现，无论在癌症哪个阶段这都是可行的。所以将拉曼成像有望被用于肿瘤学的临床应用：改进图像引导肿瘤切除，使用拉曼内窥镜进行早期癌症检测，更深层组织的非侵入性成像。
三、表面增强拉曼光谱研究电化学中膜的氧化机理[3]
早在1998年，Casado 等就研究了一系列在不同阳极电势下被电化学氧化的α-α‘-2-甲基-噻吩低聚体膜的振动光谱，结合电子吸收数据，近红外拉曼光谱表明在氧化的低聚物中存在自由基阳离子。利用掺杂诱导带的链长分布阐明了这些低聚噻吩基中带电缺陷的大小。
图4. 不同的氧化电位下DMQq的傅里叶拉曼光谱
四、受激拉曼散射显微镜实现高灵敏度的无标记生物医学成像[4]
无标记化学对比在生物医学成像中非常重要。普通的拉曼显微镜虽然能提供化学键的特定振动特征，但灵敏度低。而基于受激拉曼散射（SRS）的三维多光子振动成像技术通过施加高频（兆赫）相敏检测，能够实现极高的灵敏度，图像无背景且化学对比度易于解释。可在生物医学中应用，例如区分活细胞中ω-3脂肪酸和饱和脂质的分布，基于内在脂质对比的脑和皮肤组织成像，监测通过表皮的药物递送等。
图5. SRS原理与设计，及其与普通拉曼成像的相关对比。
图6. a. DHA, EPA, AA,OA的普通拉曼光谱，b. 脂滴（LD，红线）和细胞核内区域（蓝线）的SRL光谱，c. 2920cm-1处细胞的SRL图像，d. 3015cm-1处相同细胞的SRL图像。
图7. 小鼠组织SRL成像
小鼠脑胼胝体神经元髓鞘、脑组织、耳朵、皮肤等处-CH2 的SRL成像十分清晰，且组织中的自发荧光不会干扰SRS，与CARS成像比较，SRL成像没有非共振背景，更加直观利于解析。
五、拉曼扫描电子显微镜（RISE）成像[5]
随着各类研究的深入，科研人员对表征技术的要求也越来越多样化，不同的表征技术相互结合相互补充，做到1+1>2的现象也越来越多。有的仪器公司已经将拉曼成像和扫描电子显微镜结合，推出了拉曼扫描电子显微镜。这是一种无标记的非破坏性技术，可以用于识别样品的分子组成并成像。SEM使样品的表面结构可视化，其相关的能量色散X射线光谱学能识别元素成分，但难以表征物质的化学结构，而拉曼可以对分子结构进行分析，将两种技术集成到一起能够大大加快实验进程。拉曼扫描电子显微镜是将拉曼显微镜所需的物镜和样品台放置在SEM的真空室内，用极其精确的扫描软件驱动机制在拉曼和SEM测量位置之间转移样品。可用于纳米技术，生命科学，地球科学，制药和材料研究等领域。
图8. 拉曼扫描电子显微镜
常见的还有拉曼与AFM，气相、液相色谱联用，有兴趣的同学可以深入了解一下。
【结语】
拉曼光谱应用前景可期
表面增强拉曼和共焦显微拉曼光谱等新拉曼技术，解决了拉曼光谱在早期应用中存在的很多问题，如荧光干扰、固有灵敏度低等，而且近年来先进激光器的发展和其他光谱技术的不断革新，与气相、液相色谱，SEM/AFM等仪器的联用拓宽了拉曼光谱的应用范围，使其在研究分子微观动力学，蛋白质构相，超导体等方面发挥了重要作用。
随着纳米科学技术的迅速发展，各类制备不同纳米颗粒以及二维有序纳米图案的技术和方法将日益成熟，人们可以比较方便地在理论的指导下，寻找在过渡金属上产生强SERS效应的最佳实验条件。这些突破无疑将为拉曼光谱技术的广泛应用开创新局面。总之，通过摸索合适的表面处理方法并采用新一代高灵敏度的拉曼谱仪，可将拉曼光谱研究发展成为一个适用性广、研究能力强的表面（界面）谱学工具，同时推动有关表面（界面）谱学理论的发展。[6]